ximia.org - сайт о химии для химиков
РАЗДЕЛЫ САЙТА
Разная химия
Неорганическая
Органическая
Биологическая
Наглядная биохимия
Токсикологическая

База знаний
Химическая энциклопедия
Справочник по веществам
Таблица Д.И. Менделеева
Гетероциклические соед.
Теплотехника
Углеводы

Партнёры по Химии
Всё об Алхимии

Химия в жизни
Каталог предприятий

Дополнительно
Лекарственные средства Фармацевтический справ.

 
Всё о Химии - Ximia.org

Следующая Содержание Предыдущая

Ферментативный анализ

Ферменты играют важную роль в биохимическом анализе. В биологических материалах, например в жидкостях организма, с помощью определения каталитической активности можно обнаружить ферменты в ничтожно малых концентрациях. Ферменты можно использовать как реагенты для определения концентраций метаболитов, например уровня глюкозы в крови (схема В). В большинстве ферментативных анализов применяется фотометрия.

107

А. Основы спектрофотометрии

Многие молекулы поглощают свет в видимой или ультрафиолетовой области спектра. Это свойство можно использовать для определения концентраций. Величина поглощения зависит от типа и концентрации вещества, а также от длины волны используемого света. Поэтому применяют монохроматический свет, т. е. свет определенной длины волны, который можно выделить из белого света с помощью монохроматора. Монохроматический свет интенсивности I0 проходит через прямоугольную ячейку из стекла или кварца (кювету), в которой находится раствор поглощающего вещества. Интенсивность I выходящего света, ослабленного поглощением, измеряется с помощью детектора. Поглощение света (А) раствора (оптическая плотность) определяется как отрицательный логарифм отношения I / I0. Закон Ламберта-Бера гласит, что А пропорциональна концентрации (с) вещества и толщине (d) слоя раствора. Коэффициент экстинкции ε зависит, как было указано выше, от типа вещества и длины волны.

Б. Определение активности лактатдегидрогеназы

Определение активности лактатдегидрогеназы [ЛДГ (LDH)] основано на том факте, что восстановленный кофермент НАДН + H+ поглощает свет при 340 нм, в то время как у НАД+ (NAD+ ) при этой длине волны поглощение отсутствует. Спектры поглощения (т. е. графики зависимости А от длины волны) субстрата и кофермента в ЛДГ-реакции показаны на рис. Б1.

Различия в поглощении НАД+ и НАДН между 300 и 400 нм обусловлены изменениями никотинамидного кольца при окислении или восстановлении (см. с. 102). Для определения активности в кювету помещают прежде всего растворы лактата и НАД+ и регистрируют поглощение при постоянной длине волны 340 нм. Некаталитическая реакция протекает с очень низкой скоростью. Поэтому измеряемые количества НАДН образуются только после добавления ЛДГ. Так как скорость увеличения поглощения ΔA/Δt по закону Ламберта-Бера пропорциональна скорости реакции Δc/Δt , активность ЛДГ можно рассчитать с помощью коэффициента экстинкции ε при 340 нм или путем сравнения со стандартным раствором.

В. Ферментативное определение глюкозы

Большинство биомолекул не поглощают свет в видимой или ультрафиолетовой областях спектра. Кроме того, они обычно присутствуют в смеси с другими соединениями, которые также дают аналогичные химические реакции. Обе трудности можно преодолеть с помощью подходящего фермента для избирательного превращения определяемого метаболита в окрашенное вещество, которое далее определяют по интенсивности поглощения света.

Обычный метод определения глюкозы в крови (см. с. 162) основан на двух последовательных реакциях:
1) образование глюконолактона и пероксида водорода H2O2 под действием фермента глюкозооксидазы ;
2) окисление бесцветного вещества пероксидом водорода в окрашенное зеленое соединение в реакции, катализируемой пероксидазой.
Когда вся имеющаяся в пробе глюкоза израсходована, количество образованного окрашенного вещества можно определить по светопоглощению, которое прямо пропорционально первоначальному содержанию глюкозы.

Следующая Содержание Предыдущая

 

Всё о Химии для учителей, учеников, студентов и просто химиков